Поскольку наша разработка по искусственным хрящевым тканям в последнее время привлекла внимание прессы, здесь хочется внести некоторые корректировки и дополнения к той информации, которая содержится в видеозаписи от 4.06.2019: Петербургские ученые создали искусственный хрящ! Из Института высокомолекулярных соединений РАН прямое включение в Программе «Время суток» Телеканала «Санкт-Петербург» (https://macro.ru/2019/06/peterburgskie-uchenyie-sozdali-iskusstvennyiy-hryashh/). 

Положение дел с этой разработкой в кратком виде хорошо отражает «Заключение», подготовленное по результатам проведенных в 2014 – 2017 годах работ специалистами ФГБУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена», текст которого воспроизведен ниже.  

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ ИМЕНИ Р. Р. ВРЕДЕНА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ФГБУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена» Минздрава России)

Заключение по результатам тестирования особо прочных видов гидрогелевых материалов в качестве искусственных заменителей гиалинового хряща

В настоящее время имеется высокая потребность в биосовместимых материалах, которые могли бы длительное время функционировать в организме в качестве искусственных заменителей поврежденных тканей. Весьма актуальна разработка искусственных заменителей хрящевой ткани. Однако замещение дефектов гиалинового хряща, в том числе суставов нижних конечностей, искусственными имплантатами представляет собой сложную ортопедическую проблему. Во многом это определяется тем, что суставные хрящи при различных видах двигательной активности человека выдерживают очень высокие и длительно-действующие нагрузки сжатия: от 3 до 20 МПа, а величина относительной деформации при этом достигает 30 - 50 %.

В 2014 - 2017 гг. сотрудники ФГБУ «РНИИТО им. Р.Р. Вредена в нескольких сериях экспериментов in vivo проводили изучение возможности применения высокопрочных видов гидрогелевых материалов в качестве искусственных заменителей суставного хряща. Тестируемые материалы разработаны и исследуются коллективом Института высокомолекулярных соединений РАН. Работу выполняли в течение ряда лет в порядке инициативных поисковых исследований, а затем - в рамках проекта «Оптимизация функциональных свойств биосовместимого гидрогелевого материала «искусственный хрящ» для применения в травматологии и ортопедии при восстановлении поврежденных участков хрящевых тканей различной локализации» (руководитель - ст. научн. сотр., к.х.н. Буянов А.Л.) по Программе фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий" (ФИМТ).

В задачи нашего этапа исследования входила оценка биосовместимости предоставленных образцов композиционных гидрогелей на основе растительной или бактериальной целлюлозы и полиакриламида при их имплантации в мягкие ткани и полость коленного сустава крыс, а также изучение динамики перифокальных реакций при имплантации указанных образцов в область экспериментально созданного глубокого дефекта хряща и субхондральной кости коленного сустава кроликов.

В результате исследования было показано, что оптимизированные по составу, функциональным характеристикам, геометрии и размерам образцы композиционных гидрогелей длительно функционировали в суставах лабораторных животных в качестве искусственных заменителей гиалинового хряща: животные сохраняли полную подвижность, начиная с 2-х суток после операции и в течение всего периода исследования до 180 суток. Исследованные образцы гидрогелей продемонстрировали способность к биоинтеграции в костную ткань и хорошую биосовместимость с организмом экспериментальных животных.

Таким образом, учитывая высокие механические характеристики исследованных видов гидрогелевых материалов, превосходящие таковые для известных зарубежных аналогов, и подтвержденную нашими исследованиями биосовместимость, представляется целесообразным проведение полного объема доклинических и последующих клинических исследований единственного отечественного заменителя гиалинового хряща. 

Директор

ФГБУ «РНИИТО им. Р.Р. Bредена» Минздрава России,

проф., д.м.н.                                                                                           Р.М. Тихилов

                                                                                                                 19.08.2019 

Из приведенного выше документа понятно, что полный объем доклинических исследований гидрогелевых заменителей гиалинового хряща до настоящего времени не проводился, хотя результаты медицинских тестов, зафиксированные в ряде отчетов по гранту ФИМТ, могут являться их существенной частью. Полный объем доклинических исследований предполагает проведение ряда токсикологических тестов, регламентированных Минздравом и требует значительного финансирования.

Что касается гидрогелевых материалов, то нами разработаны два их основных вида, отличающиеся по виду используемой для синтеза целлюлозы: регенерированной растительной (РЦ), либо бактериальной (БЦ). В последнее время для синтеза особопрочных видов гидрогелей используется РЦ по ряду причин, которые наиболее подробно обсуждены в нашей статье: A.L. Buyanov, I.V. Gofman, N.N. Saprykina, 2019. High-strength cellulose–polyacrylamide hydrogels: mechanical behavior and structure depending on the type of cellulose. J. Mech. Behav. Biomed. Mater., 100.  https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2019.103385

IF = 3.485. Статью можно скачать свободно до 26 сентября по ссылке: https://authors.elsevier.com/c/1ZWjA6EHNeWzw7

 Выводы из этой статьи, которые проясняют вышесказанное, приведены ниже:

Conclusion

The PAAm-based composite hydrogels reinforced by both bacterial and plant cellulose (BC and PC, respectively) are characterized by a high stiffness in their initial state (E|_10–15% ≈ 8–9 MPa). Moreover, no appearance of visually seen destruction of both types of the materials was registered after the action of extremely severe compressions: up to 80%. In the successive compressions the stress-strain behavior of these two types of hydrogels differs significantly. This effect is caused by the substantial differences in the structures and morphologic features of the reinforcing cellulose components of the interpenetrating networks of these two types.

In accordance with the SEM data both types of hydrogels studied are characterized by the structural microheterogeneity more pronounced in the BC-PAAm hydrogel due to the inhomogeneous microfibrillar organization of the physical network of BC.

The improved homogeneity of the distribution of stiff cellulose macrochains in PC-reinforced hydrogels stabilizes their behavior under the action of high cyclic compressive loadings. Indeed, no marked decrease in the stress values was registered in the long term cyclic tests yet in the conditions of the high compression amplitudes (up to 70%). This behavior differs significantly from that of BC-based hydrogels: they cannot withstand in their initial structural state the action of cyclic compression with the amplitude more than 30–40%.

The complex hierarchy of supramolecular structure of BC causes some specific effects that take place in the processes of deformation of BC-based hydrogel compositions. The oriented tunnel-like structures with the characteristic dimensions of 10 μm and more that exist in this type of cellulose cause the anisotropic character of the mechanical characteristics of BC-PAAm hydrogels.

A great increase of the compressive stress registered while compressing the BC-PAAm hydrogels in the deformation range beyond 60% (for the previously compressed samples) can presumably be provoked by the reorientation of cellulose microfibrils under the action of this extensive compression.

The PC-based hydrogels are optimal to be used as the artificial substituent of cartilage. The hydrogels reinforced by BC are less suitable to gain this purpose. Nevertheless, they apparently could be used to the repair the zones of articular cartilage that are not subjected to the action of high compressive stresses.

Of particular interest is the anisotropy of the mechanical properties inherent to BC-PAAm hydrogels. This specific feature is similar to that registered while studying the compressive behavior of natural articular cartilages (Jurvelin et al., 2003).

The BC-PAAm hydrogels can also be treated as the promising precursors of bone tissues because, being subjected to a contact with bones in the organism, these materials are involved in the extensive mineralization process that yields a composite material containing hydroxyapatite which is close to bones by its mechanical properties (Buyanov et al., 2016).

Резюме по данным предыдущих работ (из одного проекта для РФФИ, который не сочли перспективным для финансирования):

Первые работы, которые относятся к теме по гидрогелевым биоматериалам, были опубликованы А.Л. Буяновым с соавторами еще в конце 1990-х годов  [A.L. Buyanov, L.G. Revel’skaya, Y.u.P. Kuznetzov, A.S. Shestakova, Cellulose-poly(acrylamide or acrylic acid) interpenetrating polymer membranes for the pervaporation of water-ethanol mixtures. J. Appl. Polym. Sci. 1998, v. 69, p. 761–768. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-4628(19980725)69:4<761::AID-APP14>3.0.CO;2-S,  A.L. Buyanov, L.G. Revel’skaya, Y.u.P. Kuznetzov, A.K. Khripunov. Cellulose-poly(acrylamide or acrylic acid) interpenetrating polymer membranes for the pervaporation of water/ethanol mixtures. II. Effect of ionic group content and cellulose matrix modification. J. Appl. Polym. Sci. 2001. v. 80, p. 1452–1460. DOI: 10.1002/app.1236].

В этих статьях был описан принцип синтеза гидрогелей со структурой взаимопроникающих полимерных сеток, который позволяет получать материалы с уникальным комплексом функциональных характеристик. Они состоят из жесткого целлюлозного “каркаса”, внутри которого на микроуровне встроены гибкие цепи гидрофильных полимеров, таких как полиакриламид. Присутствие последних в материале придает ему эластичность и создает необходимый уровень набухания, а жесткоцепной каркас – целлюлоза обеспечивает композиции прочность. Такая структура в некоторой степени воспроизводит строение натуральных хрящей, в которых также два основных полимерных компонента (коллагеновые волокна и протеогликаны) взаимно дополняют и усиливают друг друга.

Первые данные о показателях биосовместимости гидрогелей с составом бактериальная целлюлоза – полиакриламид, полученные в экспериментах in vitro, были опубликованы в 2003 году: Data on in vitro Parameters of Biocompatibility of Bacterial Cellulose – Polyacrylamide Composite IPN – hydrogels. In Russian. In: Scientific Works of Physicians of Leningrad Military District. St. Petersburg, 2003, P. 55 – 58.

DOI: 10.13140/RG.2.2.28155.26403

pdf – файл можно скачать здесь https://www.researchgate.net/publication/334709802_Artificial_Cartilage_Based_on_Bacterial_Cellulose_-_Polyacrylamide_Hydrogels_in_vitro_Tests_of_Biocompatibility

В последующих работах членов коллектива получены углубленные данные о структурных особенностях изучаемых систем и совокупности их физических свойств [A.L. Buyanov, I.V. Gofman, L.G. Revel’skaya, A.K. Khripunov, A.A. Tkachenko. Anisotropic swelling and mechanical behavior of composite bacterial cellulose (polyacrylamide or polyacrylamide-sodium polyacrylate) hydrogels. J. Mech. Behav. Biomed. Mater.  2010. V. 3, p. 102–111. DOI: 10.1016/j.jmbbm.2009.06.001].

В результате этих исследований показано, что разработанный авторами подход к синтезу композитных гидрогелей – синтез полиакриловой кислоты или полиакриламида непосредственно внутри целлюлозной матрицы, которую предварительно подвергали набуханию в водных растворах соответствующего мономера, содержащих также инициатор радикальной полимеризации и сшивающий агент, позволяет получить материал, структура которого представляет собой систему полимерных сеток - ВПС (физической сетки целлюлозы и химически сшитой сетки второго, синтетического полимера). Проведена химико-технологическая работа по оптимизации режимов и условий синтеза при вариации соотношения концентраций компонентов полимерной основы гидрогеля и плотности химических сшивок.

В тесной взаимосвязи с работами синтетического направления велись исследования физических свойств приготавливаемых гидрогелей, в первую очередь – механических характеристик этих материалов в различных режимах деформирования. При этом совокупность работ по синтезу гидрогелевых систем и исследованию их механических свойств была организована как «система регулирования с обратной связью»: результаты тестирования свойств вновь синтезируемых материалов использовались для оптимизации синтетических работ, для выбора направления дальнейшей модификации условий синтеза.

В результате проведенных исследований было показано, что физико-химические свойства композиционных гидрогелей определяются в основном поведением плотной сетки физических переплетений компонентов ВПС и системой внутри- и межмолекулярных водородных связей, а плотность химических сшивок влияет на эти свойства в меньшей степени. Существенно, что, как было показано в дальнейших наших работах, данный вид ВПС обладает исключительно высоким уровнем механических характеристик именно благодаря оптимальному соотношению жесткоцепного (целлюлоза) и гибкоцепного (полиакриламид и его производные) компонентов. Гибкоцепной полимерный компонент создает необходимый уровень набухания гидрогеля и придает ему эластичность, в то время как жесткоцепной полимерный “каркас” (целлюлоза) придает ему прочность и создает необходимый уровень напряжений, фиксируемый на участках сжатия до 50 – 80 %.

Существенное место в работах по рассматриваемой тематике занимали углубленные исследования возможностей применения разработанных авторами композиционных гидрогелей в медицине в качестве имплантационных материалов. Такая практическая направленность исследований объясняется установленным в работе фактом близкого подобия разработанных гидрогелей тканям человеческого организма, в первую очередь – хрящевой ткани и связкам. Это касается как высокой биологической совместимости исследуемых гидрогелей, так и сходства механических характеристик этих двух групп объектов. Работы данного направления оказались весьма актуальны в силу высокой потребности современной хирургии в имплантационных материалах данного назначения

В соответствии с этой областью востребованности разработанных материалов был развит специфический подход к режимам и условиям проведения их механических испытаний, позволяющий получить максимально полную информацию об их пригодности для работ в качестве имплантационных материалов. В частности, в используемых режимах деформирования (прежде всего – режим одноосного сжатия, наиболее близко повторяющий условия нагружения хрящевой ткани суставов) учитывались данные работ медиков и физиологов о диапазонах предельных деформаций и физиологических нагрузок, действующих в наиболее нагруженных суставах организма (коленный, тазобедренный и т.д.). Специально для оценки пригодности гидрогелевых материалов для использования в этом качестве разработана методика многократного циклического сжатия (до 10 000 циклов) гидрогелевых образцов непосредственно в водной среде с амплитудами сжатия до 50 % (что соответствует данным об условиях «работы» хрящевой ткани в суставах).

Для экспрессной диагностики механического поведения вновь синтезируемых образцов гидрогелей авторами разработана методика испытаний в режиме малоциклового сжатия с последовательным наращиванием амплитуды (по 50-100 циклов при каждой амплитуде сжатия с последовательным ее увеличением от серии к серии) [И.В. Гофман, А.Л. Буянов, А.К. Хрипунов, Л.Г. Ревельская. Деформационное поведение композиционных полимерных гидрогелей на основе целлюлозы и полиакриламида – биомедицинских материалов для протезирования хрящевой ткани человека. Деформация и разрушение материалов. 2008. № 3. С. 2-10]. Как показывает анализ научной литературы, в настоящее время эта предложенная нами методика используется многими исследователями.

Проведенные широкомасштабные механические испытания продемонстрировали высокую стабильность механических характеристик, разработанных гидрогелевых материалов в процессе длительных механических воздействий, а также возможность дизайна этих систем с направленно варьируемым комплексом свойств для достижения их близости к свойствам соответствующих биологических тканей.

Работы медицинской направленности, в частности, проводились совместно со специалистами Института травматологии и ортопедии им. Вредена в рамках проекта «Оптимизация функциональных свойств биосовместимого гидрогелевого материала «искусственный хрящ» для применения в травматологии  и ортопедии при восстановлении поврежденных участков хрящевых тканей различной локализации», выполнявшегося в 2014-2017 годах по программе Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий» (№ проекта 1.30 П, внутренний номер -  0096-2016-0009, руководитель А.Л. Буянов).

Проведенные исследования показали, что разработанные композиционные гидрогели способны функционировать в суставах лабораторных животных в качестве искусственных хрящей длительное время (до 180 суток) как в зонах суставов, которые не подвергаются значительным механическим нагрузкам, так и в их “нагрузочных” областях. Существенно, что при этом наблюдалась их хорошая биоинтеграция с хрящевыми и костными тканями, причем было показано, что в данном процессе активно участвуют клетки организма – хондроциты и остеобласты, колонии которых на границе гидрогелевого имплантата с живыми тканями фиксировались, как при морфологическом изучении окружающих тканей, так и при изучении морфологии самих имплантатов методом сканирующей электронной микроскопии. Наблюдаемый процесс остеогенеза способствовал прочной фиксации иплантируемых материалов в костных тканях суставов (материалы имплантировались в предварительно сформированные глубокие дефекты хряща и субхондральной кости).

Также комплекс прикладных исследований этих материалов с ориентацией на определение возможности их использования в имплантационной хирургии был проведен совместно со специалистами Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. ак. Павлова [A.L. Buyanov, I.V. Gofman, A.K. Khripunov, A.A. Tkachenko, E.E. Ushakova. High-strength biocompatible hydrogels based on poly(acrylamide) and cellulose: synthesis, mechanical properties and perspectives for use as artificial cartilage. Polym. Sci. A 2013. v. 55, p. 302–312. DOI: 10.1134/S0965545X13050027].

            Интересные результаты были получены в исследованиях структурно-морфологических характеристик композиционных гидрогелей [E.V. Velichko, A.L. Buyanov, N.N. Saprykina, Yu.O. Chetverikov, C.P. Duif, W.G. Bouwman, R.Yu. Smyslov. High-Strength bacterial cellulose–polyacrylamide hydrogels: mesostructure anisotropy as studied by spin-echo small-angle neutron scattering and cryo-SEM, Eur. Polym. J. 2017. v. 88, p. 269–279]. Описана сложная иерархическая организация гидрогелевых композиций. При этом, благодаря использованию комплекса для электронно-микроскопических исследований Supra 55VP (Zeiss, Германия), укомплектованного крио-приставкой PP 2000T (Quorum Technologies, Великобритания), ), а также уникальной установки для спин-эхо малоуглового рассеяния нейтронов (совместно с коллегами из Технологического Университета города Дельфт - Delft University of Technology, Delft, The Netherlands)   удалось провести уникальные исследования морфологии гидрогелей непосредственно в набухшем состоянии.         

            Таким образом, была установлена возможность существенной вариации свойств композиционных гидрогелей за счет выбора типа целлюлозной матрицы, что позволяет использовать еще один механизм направленного дизайна таких материалов с заданными характеристиками.

В моем профиле на ResearchGate можно ознакомиться с нашей презентацией по этой теме: Alexander Buyanov, Iosif Gofman, Svetlana Bozhkova. “High-strength cellulose-polyacrylamide hydrogels as biomaterials for medical application”

DOI: 10.13140/RG.2.2.31048.98562

https://www.researchgate.net/publication/329754559_High-strength_cellulose-polyacrylamide_hydrogels_as_biomaterials_for_medical_application